استخراج RNA و DNA

استخراجRNA با کمیت و کیفیت مناسب جهتreverse transcriptas PCR ، هیبریدیزاسیون در نورترن بلاتینگ و آنالیز بیان ژن با Real Time PCR از اهمیت بسیاری برخوردار است

استخراج RNA یکی از مراحل اساسی در اکثر تحقیقات انجام شده در زمینه miRNA است. روشهای متفاوتی برای استخراج RNA تام وجود دارد اما فقط برخی از آنها می توانند RNA های کوچک مولکول را حفظ کرده و استخراج نمایند

بدین منظور از نمونه مغز استخوان بدلیل غلظت بالای محتویات سلولی استفاده میشود

از محلول های tripure برای خارج کردن محتویات سلولی (به نسبت 1 به 3 با فنول و گوانیدین) و فنول برای ته نشین کردن پروتین ها و گوانیدین سیانات به منظور غیر فعال کردن DNase و Rnase استفاده میکنیم

برای استخراج باید پروتین ها و لیپید ها را حذف کرده و در نهایت RNA DNA داشته باشیم

سانتریفیوژ در دمای 4 درجه سانتیگراد باید انجام شود تا RNA تچجزیه نشود

ابتدا 200 میلی لیتر از نمونه را با 600 میلی لیتر tripure و سپس 200 میلی لیتر کلروفرم اضافه کرده و تکان میدهیم به مدت 10 دقیقه در محیط میماند تا مواد روی سلول اثر کند

از اینجای کار باید همه چیز استریل باشد و غیر استریل روی استخراج اثر منفی خواهد داشت

سپس سانتیریفیوژ به مدت ده دقیقه و دمای چهار درجه و 12000g

در تیوب سه لایه خواهیم دید

لایه اول که در بالا قرار گرفته همان RNA DNA

لایه دوم که رنگ سفید دارد پروتین های سلولی اند که رسوب داده اند

لایه زیرین و سوم اندامک ها و محتویات سلولی اند

برای از بین بردن پروتین ها از پروتاز و فنول و کلروفرم استفاده میشود و اگر بافت بود پرتاز هم در ایسنجا استفاده میکردیم

لایه اول و رویی را برداشته و با Dnase به مقدار کم 2-200 ماکرولیتر مخلوط کرده و سپس 5 دقیقه با شرایطی که بالا هم سانتریفیوژ کردیم مجددا اینکار را انجام میدهیم در صورتیکه DNA میخواستیم استخراج کنیم در این مرحله Rnase میزنیم و باقی مراحل مشابه خواهد بود

حالا لایه رویی RNA و لایه زیر DNA

RNA را برداشته و با 500 میلی لیتر ایزوپروپانول بدون ناخالصی (الکل 100%) مخلوط کرده و آرام تکان میدهیم که RNA شکسته نداشته باشیم بعد از 5 دقیقه در محیط ماندن سانتریفیوژ 12000g و 5 دقیق و 4 درجه

اینبار رسوب را برمیداریم و سوپرناتانت را دور میریزیم بازم با الکل شستشو بیشتر و خالص سازی و جدا کردن املاح را انجام میدهیم و متانول 75% حدود 500 ماکرو لیتر تا حدی که رسوب در اتانول شناور شود تا سه بار هم میشود شستشو را انجام داد

در پایان بافر TE و یا آب نکلاز فری به میزان 30 M اضافه میکنیم به رسوب RNA

برای نگه داری کوتاه مدت در دمای منفی 20 و مدت طولانی در دمای منفی 70 میتوان نگه داری کرد

نظرات شما عزیزان: